用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見(jiàn)PCR操作范例。于72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)單位，接近于7.2。二價(jià)陽(yáng)離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)表明，Mg2 優(yōu)于Mn2 ，而Ca2 無(wú)任何作用。

1．Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L（當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時(shí)），但并非對(duì)任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。shou次使用靶序列和引物結(jié)合時(shí)，都要把Mg2 濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2 過(guò)量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Mg2 不足易使產(chǎn)量降低。

樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)如磷酸根，會(huì)與Mg2 結(jié)合而降低Mg2 有效濃度。因此，用作模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時(shí)，必須相應(yīng)調(diào)整Mg2 的濃度。

2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時(shí)，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。

3．KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時(shí)能促進(jìn)引物退火。但研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時(shí)，KCl濃度高于50mmol/L將會(huì)抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對(duì)PCR結(jié)果沒(méi)有太大影響。

4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結(jié)果，影響不大。

5．二甲基亞砜（DMSO）在使用Klenow片段進(jìn)行PCR時(shí)DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使（G C）%含量高的模板易于wan全變性，在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測(cè)序更易進(jìn)行，但超過(guò)10%時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數(shù)并不使用DMSO。

PCR中Ph緩沖液的作用

第一，PCR緩沖液就是給PCR反應(yīng)提供的一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。

第二，例如緩沖液中的鎂離子在酶催化過(guò)程中，結(jié)合到酶－底物結(jié)合體上，從而使催化反應(yīng)的活化能更加降低。使得反應(yīng)能夠進(jìn)行。

第三，PH緩沖液是保證PCR反應(yīng)正常進(jìn)行的關(guān)鍵條件之一。