蛋白表達(dá)問(wèn)題一直備受關(guān)注，如何實(shí)現(xiàn)蛋白高效表達(dá)這個(gè)老生常談的話題，今天遠(yuǎn)慕來(lái)探討一下。
影響蛋白表達(dá)的因素主要有：
1.載體構(gòu)建錯(cuò)誤
這個(gè)是很多克隆新人常犯的錯(cuò)誤，在克隆時(shí)弄錯(cuò)讀碼框，從而導(dǎo)致蛋白不表達(dá)。蛋白表達(dá)載體構(gòu)建正確是蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，構(gòu)建載體時(shí)要考慮啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止子、融合標(biāo)簽、復(fù)制子等多種因素。
2.宿主菌選擇不當(dāng)
不同宿主菌的基因型不同，選擇合適的宿主菌對(duì)某些特殊的載體進(jìn)行蛋白表達(dá)至關(guān)重要。有時(shí)表達(dá)重組的毒素蛋白，對(duì)宿主細(xì)胞也有毒性，會(huì)造成質(zhì)粒丟失。
3.GC含量
不同物種間基因組的GC含量有顯著差異，GC含量通常間接對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控和影響，超過(guò)70%可能會(huì)減低蛋白表達(dá)水平。
4.密碼子優(yōu)化
（1）密碼子偏愛(ài)性
不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛(ài)性，甚至同物種內(nèi)不同功能的基因其密碼子使用頻率也存在較大的差異，密碼子偏愛(ài)性對(duì)重組蛋白的表達(dá)具有深刻復(fù)雜的影響。
密碼子的偏愛(ài)性是通過(guò)控制可用tRNA豐度影響蛋白的翻譯過(guò)程，tRNA的缺乏可能導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的稀有密碼子在蛋白表達(dá)過(guò)程中使翻譯速率降低甚至終止，從而使蛋白水平顯著降低。
（2）密碼子的使用頻率低。
某些基因本身含稀有密碼子，擁有所用宿主的稀有密碼子越多的基因，越難在該宿主中表達(dá)出理想水平的重組蛋白?？蛇x用高頻使用的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子，或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎(chǔ)上進(jìn)行重新合成，同時(shí)使密碼子組成頻率更接近宿主。
但是研究表明，密碼子的優(yōu)化必須與蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)，如果通過(guò)一味地替換稀有密碼子來(lái)提高重組蛋白的表達(dá)可能會(huì)起到適得其反的結(jié)果。
5.mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)
mRNA如果形成大而穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，尤其是起始密碼子附近的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，將會(huì)影響mRNA在翻譯過(guò)程中核糖體的結(jié)合和延伸，從而降低翻譯的效率和最終的蛋白表達(dá)水平。
如果序列里有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)/或翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，由此形成的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，會(huì)讓翻譯嘎然而止，此時(shí)就需要進(jìn)行同義密碼子替換。
因此，合理優(yōu)化翻譯起始區(qū)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，將有效提高目的蛋白表達(dá)水平。
6.mRNA的穩(wěn)定性
蛋白的表達(dá)調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄水平起關(guān)鍵作用，但同時(shí)翻譯的效率與mRNA的降解直接相關(guān)，因此，也間接影響著轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。原核表達(dá)中，存在稀有密碼子的mRNA翻譯過(guò)程受到影響，使得mRNA得不到更多核糖體結(jié)合后的有效保護(hù)，也將導(dǎo)致mRNA的降解從而使蛋白積累水平顯著降低。
7.基因突變
堿基的缺失、插入或突變，都會(huì)對(duì)翻譯的蛋白產(chǎn)生影響，在PCR擴(kuò)增時(shí)，堿基序列突變?yōu)榻K止密碼子，會(huì)導(dǎo)致蛋白翻譯意外終止。所以在進(jìn)行表達(dá)之前，通常要進(jìn)行測(cè)序來(lái)避免這種情況的發(fā)生。
當(dāng)然，影響蛋白表達(dá)的其他要素或優(yōu)化方法，還包括檢查單核苷酸重復(fù)和密碼子重復(fù)，起始密碼子環(huán)境，終止密碼子及其環(huán)境，避免內(nèi)含子、AT 富含區(qū)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) (IRES)、重組位點(diǎn)等不利元件，選擇合適的 UTR 序列和信號(hào)肽序列，合理設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)、接頭、融合基因、檢測(cè)和純化標(biāo)簽等。其他影響蛋白表達(dá)因素，歡迎小伙伴們補(bǔ)充。
