一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1.了解凝膠柱層析的原理及應(yīng)用；

2.掌握凝膠柱層析的基本操作技術(shù)，為進(jìn)一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

凝膠層析：原理與應(yīng)用

凝膠層析又稱凝凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質(zhì)的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子無法進(jìn)入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在于凝膠顆粒之間的流動(dòng)相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動(dòng)相和靜止相之間形成動(dòng)態(tài)平衡，因此就要花費(fèi)較長的時(shí)間流經(jīng)柱床，從而使不同大小的分子得以分離。

凝膠過濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以*或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值?。环粗?，則Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質(zhì)時(shí)，由于流動(dòng)相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若緩沖液連續(xù)地傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效應(yīng)也將連續(xù)地發(fā)生，其最終結(jié)果是分子量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子量小的物質(zhì)則后從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時(shí)地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子量不同的物質(zhì)相互分離開了。其分離效果受操作條件（如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。

分配系數(shù)Kav既是判斷分離效果的一個(gè)參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子量的一個(gè)依據(jù)。從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt 和外水體積Vo 以及洗脫體積Ve，即可計(jì)算出Kav值。而凝膠床總體積Vt可用測量法得到：

由凝膠床的組成可知，床體積Vt等于外水體積Vo、內(nèi)水體積Vi與凝膠顆粒實(shí)際占有體積Vg之和。即

Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi

而Vo和Vi可通過實(shí)驗(yàn)測得：當(dāng)把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時(shí)，其在內(nèi)水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等于外水體積。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積Ve應(yīng)等于凝膠床總體積，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0－1之間）。

以床體積Vt（等于pr2h）和測得值Vo來計(jì)算分配系數(shù)的值為Kav，若以床體積Vt（等于Vo+Vi）和測得值Vo來計(jì)算分配系數(shù)的值為Kd。在同一層析條件下，對同一物質(zhì)計(jì)算出來的Kav和Kd值盡管有一定的差異性，但都是有效的。只因Kav計(jì)算方便，所以目前多使用Kav。分離物在凝膠過濾層析時(shí)的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。

反應(yīng)原理

凝膠過濾不僅常用做物質(zhì)的分離，還可以根據(jù)需要用某種試劑非常方便地處理某種物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)流經(jīng)試劑區(qū)時(shí)，因?yàn)榭蛇B續(xù)接觸新鮮試劑，因而可以充分發(fā)生反應(yīng)，最后經(jīng)過洗脫，再與過量的試劑分開。本實(shí)驗(yàn)就是通過凝膠過濾，用還原劑FeSO4處理血紅蛋白。即首先在層析柱中加入含有還原劑的溶液，使形成一個(gè)還原區(qū)帶，當(dāng)血紅蛋白樣品（血紅蛋白與鐵氰/化鉀的混合液）流經(jīng)還原區(qū)帶時(shí)，褐色的高鐵血紅蛋白立即生成紫色的還原型血紅蛋白，隨著還原型血紅蛋白繼續(xù)下移，與緩沖液中的氧分子結(jié)合又形成了鮮紅的血紅蛋白。鐵氰/化鉀則因分子量小，在層析柱中呈現(xiàn)其本來的黃色帶而遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落在血紅蛋白的后邊。本實(shí)驗(yàn)操作簡便，直觀性強(qiáng)，趣味性濃，通過肉眼觀察即可檢驗(yàn)分離效果。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.器材：層析柱，?10×200

2.試劑：

(1) 20mM磷酸/二氫鈉

(2) 20mM磷酸/氫二鈉

(3) 40mM FeSO4(用時(shí)現(xiàn)配)

(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA

(5) 抗凝血（哺乳動(dòng)物血樣，以1：X的比例加入%檸檬酸鈉，置于4℃冰箱中保存。貯存期以不超過3個(gè)月為宜）

(6) Sephadex G-25

(7) 固體鐵氰/化鉀

四、儀器設(shè)備

鐵架臺(tái)、恒流泵

五、實(shí)驗(yàn)步驟

1．凝膠的處理 取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）干粉，浸泡于蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時(shí)），然后傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最后加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續(xù)浸泡（磷酸緩沖液用試劑1、2以39:51的比例混合，并用pH計(jì)校對）。

2．裝柱 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5-7cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊到入柱中，同時(shí)開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動(dòng)柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。裝柱長度至少8cm。最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的濾紙片，以防將來加樣時(shí)凝膠被沖起。

3．平衡 用磷酸緩沖液洗脫，平衡20分鐘。注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。

4．血紅蛋白樣品的制備 取1ml抗凝血于燒杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰/化鉀，使?jié)舛冗_(dá)到5mg/ml。

5．層析柱還原層的形成 取1ml 40mMFeSO4于小燒杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液攪拌均勻。待層析柱上緩沖液幾乎全部進(jìn)入凝膠時(shí)，速取該混合液0.4ml加入層析柱中，待混合液*進(jìn)入柱床后加入0.7ml緩沖液。（注意還原劑的混合液要新鮮配制，盡可能縮短在空氣中暴露的時(shí)間）。

6．上樣 將柱中多余的液體從底部流出后關(guān)閉止水螺絲,取前面制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內(nèi)。

7．洗脫 用緩沖液進(jìn)行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

8．清洗 待所有色帶流出層析柱后，加快流速，繼續(xù)清洗層析柱5min。