核酸鑒定方法之濃度/純度及完整性鑒定
點擊次數(shù)：998 更新時間：2022-05-19
核酸純化在分子生物學實驗室已經(jīng)廣泛應用。怎樣獲得高質(zhì)量、高純度的DNA或RNA樣品對下游實驗的順利進行至關重要，因此，對純化后的核酸進行鑒定也是必不/可少的步驟。本文簡單的回顧學習一下核酸鑒定的方法。
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核酸鑒定包括：濃度/純度鑒定+完整性鑒定
1.濃度/純度鑒定
（1）紫外分光光度計：
原理：由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質(zhì)。核酸在紫外光譜區(qū)有一條典型的吸收曲線，其吸收高峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的吸收高峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)是鑒定核酸的重要依據(jù)之一。
由于核苷酸最大吸收波長為260nm,根據(jù)朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度大約相當于50?g/ml的雙鏈DNA， 40?g/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測定濃度大于0.25?g/ml的核酸溶液。
計算公式:
dsDNA（?g/?l）=OD260x50x稀釋倍數(shù)/1000
RNA（?g/?l）=OD260x40x稀釋倍數(shù)/1000
純凈的DNA OD260/OD280=1.8，制備的樣品DNA比值在1.7-1.9，若洗脫時不使用洗脫緩沖液而使用去離子水，比值會偏低，因為PH值和離子存在會影響光的吸收值。
當OD260/OD280< 1.7，表明蛋白質(zhì)含量較高，可用利用酚、氯/仿、異/戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
當OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量較高?？捎肦NaseA消化后再進行純化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、鹽類或有機試劑污染。
