革蘭氏染色法，是指細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法，屬于復染法。這種染色法是由丹麥醫(yī)生革蘭于1884年所發(fā)明，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷伯肺炎菌。革蘭染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。未經(jīng)染色的細菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難區(qū)別。經(jīng)染色后，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細菌的形態(tài)、排列及某些結構特征，從而用以分類鑒定。染色原理：通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細菌細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，再用95%乙醇脫色。

革蘭氏染色液用水：培養(yǎng)基制備用水應使用電阻率不小于30萬Ωcm的蒸餾水或與其同質(zhì)的水，不使用離子交換器生產(chǎn)的去離子水。

稱量：稱量時需用多功能的角匙，預防交叉污染而影響檢驗結果；干粉培養(yǎng)基易吸潮，如有條件，盡量在濕度較低的房間稱取培養(yǎng)基。

復水：復水時不可用銅鍋或鐵鍋，防止有離子滲入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長；容器的大小需大于復水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養(yǎng)基溢出；含有瓊脂粉的培養(yǎng)基，在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘；加熱培養(yǎng)基時一定要進行攪拌，特別是瓊脂類培養(yǎng)基。

為避免燒焦和沸騰溢出，對于少量的培養(yǎng)基使用沸水浴進行加熱。燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如發(fā)現(xiàn)焦化，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出，該培養(yǎng)基即不能使用，應重新制備。

滅菌：通常培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培養(yǎng)基，按照國家標準或生產(chǎn)商提供的說明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，預防微生物生長繁殖而耗費養(yǎng)分，改變培養(yǎng)基的酸堿度。

高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，還會使瓊脂的凝膠強度下降，因此必須嚴格控制滅菌溫度和時間，并且不可重復滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進行檢定，并定期采用生物指示菌法或化學變色紙片對滅菌效果進行驗證。

pH測定：細菌必須在適宜的pH范圍內(nèi)能夠正常生長繁殖或體現(xiàn)其生物特性。培養(yǎng)基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH 值，即培養(yǎng)基使用前的pH，并應在25℃溫度下選用精密酸度計進行測量，固體瓊脂培養(yǎng)基應以特殊的膠體表面測量電極進行測量。應用過程中，如果需要調(diào)整培養(yǎng)基的pH，應用1mol/L Na0H或 lmol/L HCL調(diào)整，留意不可反復調(diào)pH，否則會影響培養(yǎng)基的滲透壓。

配置好的培養(yǎng)基保存：滅菌以后培養(yǎng)基應該迅速冷卻至所需溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi)，導致過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。所配制的培養(yǎng)基的量，應該是在最長保存期限內(nèi)正好使用完。含染料的培養(yǎng)基應閉光保存；倒好的瓊脂平板如果配制的當天未使用完，應當冷藏保存，如果保存時間超過2天，應將其放入密封的塑料袋中保存。