與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動物細(xì)胞的絕大部分mRNA在其3'端均有一 poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)-纖維素親和層析法從大量的細(xì)胞RNA中分離mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972)。在構(gòu)建cDNA文庫時， 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA模板。
 

　　進(jìn)行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結(jié)果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備Oligo(dT)-纖維素，也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。
 

　　1)用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纖維素。
 

　　2)將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)-纖維素最大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應(yīng)減少oligo(dT)-纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續(xù)步驟中損失。
 

　　3)用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液
 

　　20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
 

　　0.5mol/L NaCl
 

　　1mmol/L EDTA(pH8.0)
 

　　0.1%SDS
 

　　可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無 RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時加入已在 65℃預(yù)熱30分鐘的10 %SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。
 

　　4)用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當(dāng)所的RNA溶液均進(jìn)入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級結(jié)構(gòu)。
 

　　5)當(dāng)全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。
 

　　6)用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測定每一收集管的OD260。最補(bǔ)由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床， OD260會很高，后來OD260值則很小或為零。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱術(shù)體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。
 

　　7)用2-3倍柱床體積的經(jīng)滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3-1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液
 

　　10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
 

　　1mmol/L EDTA(pH8.0)
 

　　0.05%SDS
 

　　用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應(yīng)為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓會使溶產(chǎn)生大量氣泡。
 

　　8)收集液置于透明的小溶器內(nèi)，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇(1：1)浸泡1小時，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水*沖洗合并含有RNA的洗脫組分。經(jīng)上述一輪 oligo(dT)-纖維素親和量層析后得到的RNA中，帶與不帶poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲進(jìn)一步純化mRNA，可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5mol/L，用同一oligo(dT)纖維素柱進(jìn)行第二輪層析。
 

　　9)收集 oligo(dT)-纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預(yù)冷的乙醇，混勻，冰浴至少30分鐘。
 

　　10)于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly(A)+RNA，小心棄去上清液，用70 %乙醇洗滌沉淀(通常看不見沉淀)，離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。
 

　　11)用少量水重溶RNA，置于比色杯內(nèi)，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇(1：1)浸泡1小時，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水*沖洗。
 

　　12)將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內(nèi)，加3倍體積乙醇， 混勻，于-70℃保存?zhèn)溆??；厥誖NA時，只需取出一小份貯存液，加3mol/K乙酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3mol/L， 混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
 

　　i.OD260=1的溶液其RNA含量約為40μg/ml.
 

　　ii.從 107個哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞中可獲得1-5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的總RNA的1-2%。