一、蛋白樣品制備
 

　　之前和大家介紹過(guò)細(xì)胞和組織蛋白質(zhì)的提取，當(dāng)我們做WB的時(shí)候，需要對(duì)提取好的蛋白樣品進(jìn)行處理：在蛋白樣品中加入SDS loading buffer 6X(蛋白上樣緩沖液)稀釋至1X(如蛋白樣品有120ul，則加入SDS loading buffer 6X 600ul)，混勻，75-95度加熱10-15分鐘，使蛋白變性以充分暴露抗原位點(diǎn)。在加熱結(jié)束后，進(jìn)行離心，使蛋白樣品適當(dāng)降溫，防止PAGE膠被融化。
 

　　PS：要測(cè)量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加熱到75度，一般情況可95度加熱。市面上買(mǎi)到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀釋至1X即可。
 

　　那么為什么我們加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在電泳中起了關(guān)鍵的作用。
 

　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚藍(lán)，作為指示劑，方便觀察電泳進(jìn)行的程度；B：10%甘油，密度大，增加樣本的重量，可攜帶樣本沉到底部；C：2%SDS，是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，按一定比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成為復(fù)合物，是蛋白質(zhì)帶滿負(fù)電荷，從而是蛋白帶電荷一致，減少電荷對(duì)電泳結(jié)果的影響；D：巰基乙醇還原劑，使蛋白質(zhì)的二硫鍵斷開(kāi)，使得蛋白保持線性結(jié)構(gòu)。
 

　　二、蛋白上樣
 

　　1. 將之前配好的膠固定在電泳裝置上，加入1X電泳液
 

　　2. 拔出梳子，應(yīng)該兩側(cè)同時(shí)用力，緩慢拔出，注意在拔除梳子時(shí)防止氣泡進(jìn)入梳孔使其變形，若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。
 

　　3.加入蛋白樣品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul  -40ul蛋白樣品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul  -30ul蛋白樣品，是用微量注射器加樣，平時(shí)我們也可以用普通的移液槍加樣，盡量讓槍頭深入梳孔底物，防止蛋白樣品飄出，一般在目的蛋白兩側(cè)加入等量的marker，如果兩側(cè)有空的梳孔，應(yīng)該加入1X的loading buffer，起“壓邊”作用，可以使蛋白樣品在一條水平線上往下跑。
 

　　4.電泳：接上電極，正負(fù)極不要弄反，紅色對(duì)紅色，黑色對(duì)黑色，初始電壓設(shè)為90V，當(dāng)樣品跑至分離膠時(shí)將電壓調(diào)至120V，一般在溴酚藍(lán)跑出膠時(shí)停止電泳，也可根據(jù)目的蛋白的分子量來(lái)選擇跑的時(shí)間，如分子量較大，可以延長(zhǎng)電泳時(shí)間，使得分子量大的marker跑的分散開(kāi)，容易判斷分子量。
 

　　三、注意事項(xiàng)
 

　　1.蛋白樣品上樣量最好相等，不要過(guò)多。
 

　　2.不要過(guò)多重復(fù)使用電泳Buffer
 

　　3.最佳分辨區(qū)在分離膠的2/3
 

　　4.電泳后測(cè)定的分子量有10%的誤差，不可*信任。有些蛋白質(zhì)由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上的肽鏈(α-胰凝乳蛋白酶)組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈，SDS-PAGE電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量，有的蛋白質(zhì)(如電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì))不能采用該發(fā)測(cè)相對(duì)分子量。
 

　　5.如果電泳中出現(xiàn)拖尾，染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。