底物顯色是后一步，也是-有文章可做的一步。顯色的標(biāo)記方式有生物素標(biāo)記、地-高辛標(biāo)記、各種酶標(biāo)記等等，酶標(biāo)的底物又有各種生色底物、化學(xué)發(fā)光法底物和熒光底物可供選擇，顯色方法多種多樣，下面我們針對(duì)常用的幾類方法進(jìn)行總結(jié)對(duì)比分析，供大家方便在以后實(shí)驗(yàn)中根據(jù)自己需求進(jìn)行選擇。

酶促反應(yīng)較生物素安全且反應(yīng)快速，是WB 中的主流顯色方法。酶促反應(yīng)根據(jù)不同底物顯色方法又包括化學(xué)發(fā)光和底物顯色?；瘜W(xué)發(fā)光法靈敏度高，可以達(dá)到pg級(jí)，而底物顯色由于直接顯色而操作簡單且成本低。-為大家所熟悉的底物顯色當(dāng)數(shù)HRP（辣根過氧化物酶，Horseradish Peroxidase ）和AP（堿性磷酸酶，Alkaline Phosphatase ）。

HRP

這是-常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶，由于HRP 比活高、分子量小、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和作用底物范圍廣的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛使用。HRP的底物主要包括化學(xué)發(fā)光底物和生色底物兩大類，對(duì)于底物的選擇，主要考慮的是靈敏度、背景和使用的方便性和穩(wěn)定性。

1 生色底物

生色底物顯色主要是利用底物在有HRP 和H2O2的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累這一過程檢測WB 的結(jié)果。生色底物主要包括DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。表1對(duì)這4種生色底物從不同方面進(jìn)行比較。其中，DAB應(yīng)該是熟悉的底物，靈敏度高，特異性好，缺點(diǎn)就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時(shí)會(huì)褪色，不能永-久保存，而且有毒。4-CN反差大容易拍照，可與DAB聯(lián)用。TMB的信噪比高，成分安全，特別合適于靈敏度要求高的WB，但是也要避免由于靈敏度高而引起的高背景，因此可以相應(yīng)的延長封閉的時(shí)間和注意洗滌的次數(shù)。AEC各方面性質(zhì)與DAB相似，但靈敏度要差一點(diǎn)。

2 化學(xué)發(fā)光底物

化學(xué)發(fā)光底物-常用的是魯米諾（Luminol ），化學(xué)發(fā)光法由于僅在酶和底物都存在的時(shí)候才會(huì)發(fā)光，不同于生色反應(yīng)，所以特別適合在同一張膜上對(duì)不同的目標(biāo)蛋白分別進(jìn)行多次檢測。目前-高檢測靈敏度已經(jīng)達(dá)到低飛克（Femto）級(jí)別，成為安全且靈敏度-高的WB檢測方法。

ECL 在許多研究人員心目中的幾乎成為化學(xué)發(fā)光法的代名詞，也是文章的保證之一。一般含有魯米諾、H2O2和發(fā)光增強(qiáng)劑等物質(zhì)。發(fā)光試劑中的魯米諾被HRP 和H2O2氧化，產(chǎn)生熒光，這個(gè)過程被發(fā)光增強(qiáng)劑加強(qiáng)。其中，增強(qiáng)劑在體系中扮演著核心角色，決定著ECL 化學(xué)發(fā)光的發(fā)展。化學(xué)發(fā)光的常見問題主要是抗體濃度過高，所以抗體用量要比規(guī)定的稀釋倍數(shù)放大，確保不會(huì)因?yàn)镠RP過量導(dǎo)致底物過快消耗完而引起結(jié)果不穩(wěn)定。

AP

AP 作為一種經(jīng)典常用的顯色交聯(lián)酶，自有其優(yōu)點(diǎn)，如AP的底物顯然geng穩(wěn)定。AP顯色的靈敏度已經(jīng)可以達(dá)到低pg級(jí)，但前提是封閉要做得好。常用的AP包括BCIP（5- 溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽）、NBT（四唑硝基藍(lán)）和INT （硝基四紫唑），以及它們之間的組合使用，如表2。

這其中，BCIP/NBT是堿性磷酸酶-佳的底物組合之一，其靈敏度-高，顯色比較銳利，成像性也比較好，因此-常被用到。

各種顯色方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，上面這些介紹讓大家對(duì)各種產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)一覽無遺，希望這些內(nèi)容可以給大家?guī)韼椭?，早日成為一個(gè)WB 高手。當(dāng)然，還要提醒大家，注意操作時(shí)佩戴手套，部分顯色試劑有毒性，避免與皮膚直接接觸，記得用后及時(shí)*沖洗。