試驗?zāi)康?血清分型
標(biāo)本 出血熱恢復(fù)期病人血清
材料
1、 毒株 漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株 76－118，漢城病毒標(biāo)準(zhǔn)株 Seoul；
2、標(biāo)準(zhǔn)血清 兔抗?jié)h灘病毒、漢城病毒血清；
3、空斑減少中和試驗常用試劑。
步驟
1、將待檢血清用牛血清Hanks 氏液稀釋成1：10，56℃滅活30分鐘；
2、進(jìn)一步2倍稀釋血清成1：20、1：40、1：80……，對照血清1：10稀釋；
3、稀釋兩種病毒（在冰浴中進(jìn)行）至含200pfu/ml；
4、各連續(xù)稀釋度血清分別與200pfu/ml的兩種病毒液等量混合（各0.3ml），置37℃中作用1小時（每15分鐘振蕩一次）；
5、吸出各細(xì)胞培養(yǎng)孔中維持液；
6、接種長滿單層的Vero-E6細(xì)胞（24孔板），每孔接種血清病毒混合液、標(biāo)準(zhǔn)血清對照及兩種病毒對照 ，每稀釋度兩孔，100ul/孔。37℃吸附1小時，每隔15分鐘搖動一次；
7、加*層瓊脂糖覆蓋液（需冷置42℃左右），每孔1ml，室溫下待凝固，細(xì)胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)7-9天；
8、加第二層含中性紅瓊脂糖覆蓋液，1ml/孔，室溫下待凝固，細(xì)胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)2-5天，從第二天開始觀察空斑數(shù)；
9、抗體滴度的判定，以比病毒對照的空斑數(shù)中和或減少50%的血清zui高稀釋度倒數(shù)判為待檢血清中和抗體滴度；
10、型別判定：根據(jù)同一份血清與兩種病毒的反應(yīng)滴度不同來區(qū)分，如果一份血清與漢灘病毒 （或漢城病毒）反應(yīng)的抗體滴度高于與漢城病毒（漢灘病毒）的抗體滴度4倍或以上，即判為漢灘病毒型，反之則為漢城病毒型。兩者滴度相差無幾時，則不好分型。不足4倍時亦不能定型。
配方
1、*層瓊脂糖覆蓋液
| 2×Eagle MEM液 | 50ml（Gibco-BRL） |
| 滅活胎牛血清 | 10ml |
| L-谷氨酰胺 | 4ml（200mmol/L,100X） |
| MEM非必需氨基酸 | 1ml（Gibco,100x） |
| 1mol/L HEPES緩沖液 | 2ml |
| 青鏈霉素 | 1ml（青霉素10000u/ml,鏈霉素10000ug/ml） |
| 制霉菌素（一般可以不加） | 0.1ml |
| 臨用前配制，放入42℃水浴中，另取 | |
| 瓊脂糖 | 0.6g（Sigma, Type II medium EEO） |
| 超純水 | 34ml（適用于細(xì)胞培養(yǎng)的純化水） |
| 8磅高壓滅菌15min，置42℃水浴15min，加入上述配制的組分中，即可使用。 | |
2、第二層瓊脂糖覆蓋液 基本上同*層瓊脂糖覆蓋液，僅將滅活胎牛血清改為5ml，另加中性紅溶液1ml（333.0ug/L中性紅鈉鹽Gibco）。
