原代細(xì)胞在相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用過程中越來越多，人們不再單單趨于使用細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，因?yàn)榧?xì)胞系常常由于體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，而容易丟失原有的生物學(xué)特性，對(duì)藥物處理的反應(yīng)差距越來越大。

        原代細(xì)胞剛從組織中分離開，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也接近和反應(yīng)體內(nèi)生長(zhǎng)特性，原代細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)狀態(tài)都比較好，細(xì)胞的純度和基因保留可達(dá)到 90% 以上，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等試驗(yàn)研究，使用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以獲得更準(zhǔn)確的研究和數(shù)據(jù)。

         為了更好的服務(wù)于廣大科研工作者，遠(yuǎn)慕生物技術(shù)人員特提供了角質(zhì)形成細(xì)胞分離的常用方法，技術(shù)因人而異僅供參考：

         角質(zhì)形成細(xì)胞是一種不斷分化的復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞，其分化的終階是形成角蛋白。根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞的發(fā)展階段和特點(diǎn)，從內(nèi)向外可將其分為五層?；准?xì)胞層又稱生發(fā)層，棘細(xì)胞層，顆粒層，透明層，角質(zhì)層。

         角質(zhì)形成細(xì)胞的分化成熟表現(xiàn)為從基底層到向角質(zhì)層的逐漸移行。在單一移行過程中，角質(zhì)形成;細(xì)胞的形狀和功能也逐漸發(fā)生著變化，從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細(xì)胞核消失的角質(zhì)層。新生的基底細(xì)胞進(jìn)入棘細(xì)胞層，然后上移到顆粒層的上層。細(xì)胞組織來源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常皮膚組織，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)為貼壁培養(yǎng)。

需要的實(shí)驗(yàn)試劑：
1.培養(yǎng)基 1：iCell 原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系
4.基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12
5.緩沖液：無菌不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1×PBS+1×P/S，pH=7.4
6.消化液 1：1.2U/ml 的 dispase Ⅱ
7.消化液 2：0.25% 胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液 3：0.1%Ⅰ 型膠原酶
9.75% 醫(yī)用酒精
10.胎牛血清（FBS）

實(shí)驗(yàn)器械：
1.培養(yǎng)皿
2.T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶
3.100 目不銹鋼網(wǎng)篩
4.200 目不銹鋼網(wǎng)篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管（15ml、50ml）

實(shí)驗(yàn)步驟：
1.新鮮的bao皮組織，裝盛于含有無菌生理鹽水或 1×PBS 的無菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體 6h 內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分離。
2.在無菌環(huán)境中取出bao皮組織，用 1×PBS 清洗 2-3 次去除表面血液后，75% 的酒精浸泡 100s
3.酒精浸泡組織后快速將組織轉(zhuǎn)入裝有 1×PBS 的培養(yǎng)皿中震蕩清洗數(shù)次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織（脂肪，微血管等）
4.將去除了脂肪和微血管組織的再用 1×PBS 清洗幾次后，剪成 3mm*8mm 左右的皮片，用消化液 1  4 度消化過夜（15-18h）。
5.第二天，用 2 個(gè)眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織，分離和表皮；
6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液 3 37 度水浴消化1h。
7.消化完成后用移液器充分吹打 100 次左右，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，過 200 目不銹鋼網(wǎng)篩后取濾懸液，轉(zhuǎn)入 15ml 離心管中，400g 離心 10 分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用 3ml 的 1×PBS 吹打重懸后，400g 離心 5min 離心完成后棄去上清，沉淀用 2ml 的原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸后，轉(zhuǎn)入已經(jīng)裝有 2ml 培養(yǎng)基的 T-25 培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于 37℃ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8.視細(xì)胞貼壁情況 48-72h 后換液去除未貼壁的細(xì)胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和培養(yǎng)基顏色每 2-3d 換液一次；待細(xì)胞貼壁率達(dá)到 80-90% 后，進(jìn)行常規(guī)傳代擴(kuò)增操作（角質(zhì)細(xì)胞對(duì)胰酶不太敏感，消化時(shí)間可能會(huì)增加到 10-15 分鐘，有時(shí)需要配合使用無菌細(xì)胞刮鏟進(jìn)行傳代）。